多肽分析過程中有哪些常見問題呢？小分子越來越難做，大分子發(fā)展很強(qiáng)勢(shì)，似乎成為了近年來藥物研發(fā)市場(chǎng)的重要表現(xiàn)之一，“多肽”類藥物正是其中的一大熱門。目前多肽藥物的質(zhì)量監(jiān)管日趨漸嚴(yán)，在這種趨勢(shì)下，尋找能滿足更高分離度，靈敏度的分析方法就顯得尤為重要。很多小伙伴在在開發(fā)多肽類樣品分析方法中總是遇到各種的問題。這里小編就總結(jié)了一些在多肽方法開發(fā)中常見的問題分享給各位小伙伴。剛興趣的也可看看多肽藥物系列文章。

1、多肽含量與多肽純度有什么區(qū)別？

一條多肽產(chǎn)品中除了多肽本身還包括生產(chǎn)過程中帶入的水份及有機(jī)鹽分等雜質(zhì)，多肽純度僅指多肽本身所含肽產(chǎn)品的含量及雜質(zhì)的含量，不包括水份等雜質(zhì)；而多肽含量則是指目標(biāo)多肽在產(chǎn)品中的凈含量，一般以N元素分析或氨基酸分子的方法來檢測(cè)；因此一條多肽即使純度達(dá)到百分之99，因?yàn)楫a(chǎn)品中還包含水份及有機(jī)鹽分等，它的含量可能也只有百分之70-80。

2、如何溶解多肽？

多數(shù)多肽都可以用超純水溶解，對(duì)于一些難溶的多肽，先要分析其氨基酸序列，對(duì)于酸性多肽，可先以小量堿性（如百分之0.1氨水）溶液溶解，然后稀釋至所需濃度，對(duì)于堿性多肽，可先以小量酸性（如醋酸，三氟乙酸）溶液溶解，然后稀釋至所需濃度，對(duì)于疏水性多肽，可用有機(jī)溶劑溶解，如DMF，甲醇，丙醇，異丙醇，DMSO等。

3、為什么流動(dòng)相中要加入三氟乙酸作為離子對(duì)試劑，還有哪些流動(dòng)相體系或離子對(duì)試劑可用于多肽的分離純化？

加入三氟乙酸能調(diào)節(jié)洗脫液的PH，同時(shí)作為離子對(duì)試劑與多肽相互作用，從而增強(qiáng)分離效果，明顯改善峰形。

其它可用于多肽分離純化的流動(dòng)相體系或離子對(duì)試劑包括醋酸體系，磷酸體系，鹽酸體系，七氟丁酸等通過適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)PH都能取得很好的分離效果。

另外三氟乙酸優(yōu)于其他離子修飾劑的原因是它容易揮發(fā)，可以方便地從制備樣品中除去，另一方面，三氟乙酸的紫外吸收峰低于200nm，對(duì)多肽在低波長處的檢測(cè)干擾很小。

4、檢驗(yàn)多肽的色譜柱出現(xiàn)柱壓升高，柱效下降該如何解決？

日常對(duì)色譜柱沖洗維護(hù)可以遵循色譜柱出廠說明書，但是在分析多肽等蛋白質(zhì)樣品時(shí)還容易出現(xiàn)一種現(xiàn)象：蛋白污染。主要是柱頭端填料出現(xiàn)結(jié)塊，如果出現(xiàn)蛋白污染，建議使用乙腈-水-三氟乙酸 = 50-50-0.1小流速反向沖洗60倍柱體積或者反向沖洗過夜。

5、多肽樣品在新的硅膠基質(zhì)色譜柱上不出峰或者峰面積異常小，這是為什么？

這是因?yàn)槿嗫浊蛐喂枘z柱上的非特異吸附位點(diǎn)對(duì)多肽產(chǎn)生死吸附從而導(dǎo)致不出峰。

色譜柱中非特異性吸附位點(diǎn)主要來源于殘留的硅醇基、硅膠中的殘留重金屬、鍵合相脫落后暴露的硅羥基，柱管內(nèi)壁沒有被鈍化的位點(diǎn)。這些都會(huì)對(duì)多肽樣品有較強(qiáng)的非特異性吸附。

其實(shí)在開始使用新色譜柱時(shí)，對(duì)生物樣品這樣的非特異性吸附會(huì)比較嚴(yán)重，可以對(duì)色譜柱進(jìn)行高濃度樣品飽和處理。在正式檢測(cè)前預(yù)先進(jìn)樣，使樣品在柱子上累積，覆蓋住這樣的位點(diǎn)，才會(huì)使我們以后的分析有好的色譜圖。建議隔一分鐘進(jìn)一次樣，連續(xù)進(jìn)十幾針，用過量樣品覆蓋掉非特異性吸附位點(diǎn)。等峰面積，峰形穩(wěn)定后就可以正式檢測(cè)樣品。

6、TFA在緩沖液中是不是只起到調(diào)節(jié)PH的作用？TFA的濃度越高基線漂移越厲害，那是不是說TFA的濃度在緩沖液PH允許的情況下越低越好？

（1）TFA起到類似離子對(duì)的作用，一般濃度在百分之0.05-0.1，過高的濃度，會(huì)使溶液偏酸，長時(shí)間使用可能影響柱子壽命。

（2）同時(shí)TFA可以壓制硅膠表面硅醇基，改善堿性化合物的峰型。有時(shí)百分之0.1TFA分離不好的話?？梢钥紤]加大濃度到百分之0.2。但要注意用完后及時(shí)沖洗色譜柱。

7、在多肽檢測(cè)過程中經(jīng)常出現(xiàn)基線漂移的原因是什么？怎么解決？

固定三氟乙酸濃度的梯度洗脫有時(shí)會(huì)在210-220nm檢測(cè)處造成吸收基線的漂移，這是許多反相分離中基線漂移的原因。

降低或消除由于三氟乙酸光譜吸收變化引起的基線漂移需要盡量使檢測(cè)波長靠近215nm，并在溶劑B中比在溶劑A中少加百分之15的三氟乙酸補(bǔ)償基線漂移。例如溶劑A中的三氟乙酸為百分之0.1時(shí)，溶劑B中可用百分之0.085。

8、如何選擇純化過程中使用的色譜柱填料？

不同序列的多肽理化性質(zhì)及疏水性有很大的區(qū)別，多數(shù)情況分子量小于4000和親水性多肽用Ｃ18柱分離效果好，分子量大于5000和疏水性的多肽以Ｃ4柱分離效果好，而Ｃ8柱介于Ｃ18和Ｃ4柱之間，其應(yīng)用效果與Ｃ18柱更相似；對(duì)一些特殊選擇性的多肽，也可選擇苯基柱。

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